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人ApoE基因编码载脂蛋白E，位于第19号染色体上，全长3647bp，有4个外显子和3个内含子，编码317个氨基酸。ApoE基因有两个SNPs，分别是rs429358(c.388T>C)和rs7412(c.526C>T)。它们分别导致ApoE蛋白第112位和第158位氨基酸的改变，从而产生3种常见的ApoE亚型，分别是E2(388T-526T)、E3(388T-526C)和E4(388C-526C)。ApoE3被认为是野生型，第112位是半胱氨酸，158位是精氨酸。突变型ApoE2的两个位点都是半胱氨酸，突变型ApoE4的两个位点都是精氨酸。

全基因组关联分析证实，ApoE的E4等位基因是阿尔茨海默病(AD)最强的遗传风险因素。只要携带一个E4等位基因，无论另外一个等位基因是E2还是E3，AD发病率会增加3～4倍。如果携带两个E4等位基因，AD发病率会增加9～15倍。因此快速检测rs429358(c.388T>C)点突变具有重要的意义。为此本公司开发了简单快捷的检测该位点的点突变探针法qPCR检测试剂盒。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到1000拷贝/μL。
   
3. 能检测出5%的点突变。
   
4. 提供两种阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
5. 特异性高，引物是根据ApoE基因rs429358位点设计，不会跟其他位点的DNA发生交叉反应。
   
6. 本制品只能定性，不能定量。

1. 如果有N个样品，则进行N次纯化，得到的DNA最后溶解在TE中，并需要用NanoDrop进行定量。最后的浓度不能低于0.2μg/μL。
   
2. 本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。

3. 如果只做1次重复，则标记N+3个PCR管，其中N个用于上步得到的N样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板，NC)，3个用于阳性对照(分别对应两种纯合子基因型和一种杂合子基因型)。
   
4. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
   

   成分	N个样品管	NC	TT	TC	CC
   2×点突变Probe qPCR MagicMix	各10μL	10μL	10μL	10μL	10μL
   rs429358位点检测引物-探针混合液	各4μL	4μL	4μL	4μL	4μL
   N个DNA样本	各3μL
   超纯水	各3μL	6μL	3μL		3μL
   rs429358位点TT阳性对照(1×104拷贝/μL)			3μL	3μL	不加
   rs429358位点CC阳性对照(1×104拷贝/μL)				3μL	3μL

5. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
   

   过程	温度	时间
   预变性	95℃	90sec
   PCR循环 (45个)	95℃	15sec
   	60℃	60sec(采集FAM和HEX通 道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA)

6. 一般的荧光定量PCR仪在基因分型的模式下，都可以自动根据两个通道获得的荧光值，计算每个样品的比值(HEX值/FAM值，HEX为突变探针标记，FAM为野生型探针标记)，并描出散点图。突变基因型的比值点将位于散点图的Y轴方向，正常基因型的比值将位于X轴方向，杂合子基因型的比值将位于中间，阴性对照的比值将位于原点附近。如果阴性对照有任何信号，则表示污染，本次实验无效，需要寻找原因。
   也可以手动整理下表进行基因型判断。首先设置阈值，FAM的阈值根据TT阳性对照的FAM荧光值设置，HEX的阈值根据CC阳性对照的HEX荧光值设置。如果阴性对照有任何信号，则表示污染，本次实验无效，需要寻找原因。如果实验有效，则分析样品。如果样品Ct值低于35，则算有扩增。高于35，则算无扩增。
   

   阳性对照	FAM通道	HEX通道	基因型
   CC阳性对照	无扩增	有扩增	纯合突变
   TC阳性对照	有扩增	有扩增	杂合突变
   TT阳性对照	有扩增	无扩增	正常
   阴性对照	无扩增	无扩增	-